Определение адениловых нуклеотидов эритроцитов методом тонкослойной хроматографии (ход исследования)

Кровь берут с гепарином, добавляя его из расчета 12 ME на 1 мл крови. Эритроциты отделяют центрифугированием, плазму отсасывают, а клетки 3 раза промывают холодным изотоническим раствором натрия хлорида, каждый раз центрифугируя по 20 мин при скорости 3000 об./мин. К 1 мл эритроцитной массы добавляют 1 мл раствора хлорной кислоты, перемешивают и через несколько минут осадок отделяют центрифугированием.

К 1 мл надосадочной жидкости прибавляют 0,1 мл раствора калия карбоната и оставляют на холоде, пока полностью не выпадут кристаллы образовавшегося перхлората калия. 0,05—0,1 мл холодной надосадочной жидкости (если она согреется, кристаллы частично растворяются) наносят в виде полоски на пластину «Силуфол» и проводят восходящую хроматографию в течение 60—90 мин в смеси диоксана, изопропилового спирта и аммиака. Перед началом хроматографии камера должна быть насыщена парами растворителя, фронт растворителя должен пройти расстояние не менее 3/4 пластины, если он не пройдет его, то наиболее вероятная причина этого — плохое насыщение камеры парами подвижной фазы или плохая герметизация камеры.

Вынутые из камеры пластины высушивают на воздухе и просматривают в коротком ультрафиолетовом свете (на ультрахемоскопе Блюмберга или другом аналогичном приборе), находят пятна нуклеотидов и обводят их острым предметом.

В этой системе быстрее всего движется АМФ, медленнее — АТФ. Порошок с отмеченных мест пластины соскабливают и элюируют 3 мл 0,1 н НСl. Определяют светопоглощение надосадочной жидкости при длине волны 260 нм.

При налаживании методики рекомендуется провести определение в калибровочном растворе, содержащем в 1 мл 30—60 нмоль (15—30 мкг) ампулированного препарата АТФ, который непосредственно наносят на хроматографическую пластину так же, как и нейтрализованный хлорный экстракт. Эти препараты обычно, помимо АТФ, содержат также АДФ и АМФ.

Расчет проводят исходя из молярных коэффициентов экстинкции: для АТФ — 14 600, для АДФ — 15 000, для АМФ — 14 700. Если для хроматографии было взято 0,1 мл нейтрализованного экстракта и окончательный объем после элюации был 3 мл, разведение составляет 1 : 63, поэтому для того чтобы выразить концентрацию АТФ в мкмоль/л, надо величину умножить на 4315, для АДФ коэффициент составляет 4200, для АМФ — 4286. Если же для хроматографии берут 0,05 мл нейтрализованного экстракта, коэффициенты должны быть в 2 раза выше.

Нормальные величины: содержание АТФ — 726 ± 2,4 мкмоль/л, содержание АДФ — 262 ± 1,2 мкмоль/л, АМФ — 4,1 ± 1,3 мкмоль/л.

Далее по теме: