Определение нуклеотидов эритроцитов электрофоретическим методом (ход исследования)

Кровь берут с гепарином из расчета 0,1 мл на 5 мл крови. Эритроциты отделяют центрифугированием, плазму отсасывают, а клетки дважды промывают изотоническим раствором натрия хлорида при температуре 4 °С, каждый раз центрифугируя, отсасывая надосадочную жидкость и вновь ресуспендируя в новой порции раствора. К 0,5 мл эритроцитной взвеси добавляют 0,5 мл 15%-ной трихлоруксусной кислоты, перемешивают палочкой, выдерживают при температуре 4 °С в течение 10 мин и центрифугируют. Надосадочную жидкость используют для определения нуклеотидов.

Электрофоретическую камеру заполняют цитратным буфером рН 5,1 и смачивают бумагу для электрофореза согласно правилам работы на приборе. На место старта равномерной поперечной полосой наносят 0,05 мл исследуемого трихлоруксусного экстракта и проводят электрофорез при напряжении 12—14 В/см при силе тока 0,5—1 мА на 1 см поперечного сечения ленты в течение 3,5 ч. После этого электрофореграммы высушивают в темноте и рассматривают при освещении коротким ультрафиолетовым светом (длина волны меньше 300 нм, можно пользоваться ультрахемоскопом Блюмберга или другим аналогичным прибором). Бумага слегка флюоресцирует за счет примесей, а адениловые нуклеотиды, которые сильно поглощают свет в этой области, видны в виде темных пятен.

Ближе к старту находится АДФ, дальше от старта — АТФ. Контуры пятен обводят карандашом, вырезают и элюируют 5 мл 0,01 н НСl в течение 4 ч. Одновременно экстрагируют аналогичный участок бумаги, не содержащий нуклеотидов, этот раствор используют в качестве холостого опыта. Экстинкции всех растворов измеряются при длине волн 260 и 290 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см, из первой величины вычитают вторую.

Расчет основывается на данных молярного коэффициента экстинкции при длине волны 260 нм, который у разных нуклеотидов несколько различается, однако этими небольшими различиями можно пренебречь и принять его равным 14,2 ґ 103. Это значит, что такая величина оптической плотности получится, если фотометрировать в кювете с длиной оптического пути 1 см раствор концентрации 1 моль/л и вычесть из этой величины оптическую плотность при 290 нм. Для раствора концентрации 1 мкмоль/л величина будет 0,0142.

В данном методе окончательное разведение пробы в 200 раз (нуклеотиды из 25 мкл эритроцитной массы оказываются в 5 мл), поэтому расчет производят по формуле:

Е ґ 200/0,0142 = Е * 14 085 мкмоль/л эритроцитарной массы,

где Е — разность оптических плотностей, измеренных при длинах волн 260 и 290 нм.

Нормальные величины: для АТФ — 600—1400 мкмоль/л, для АДФ — 250—800 мкмоль/л, отношение молярных концентраций АТФ/АДФ в норме 2).

Далее по теме: