Возбудитель заболевания — Corynebacterium diphtheriae, или палочка Леффлера. Дифтерийные коринебактерии аэробы, грамположительны, неподвижны, спор не образуют; их концы булавовидно утолщены за счет зерен волютина или зерен Бабеша-Эрнста (скоплений полифосфата). В мазках располагаются попарно, часто в виде римской цифры V. При окраке по Нейссеру тело бактерий окрашивается в коричнево-желтый, а скопления полифосфата — в синий цвета.
Коринебактерии хорошо растут на средах, содержащих сыворотку и кровь. Оптимальные условия для роста в теллуритовом агаре (среда Клауберга).
Выделяют три культурально-биохимических типа С. dipththeriae (mitis, gravis, intertnedius), из них наибольшей вирулентностью обладает тип gravis.
Различают токсигенные и нетоксигенные штаммы С. diphtheriae. Дифтерию вызывают лишь токсигенные штаммы, продуцирующие экзотоксины (дермонекротоксин, гемолизин, нейраминидазу и гиалуронидазу).
Возбудитель хорошо сохраняется в окружающей среде. Так, в воде и молоке дифтерийная палочка жизнеспособна 7 дней; на игрушках, белье, книгах, посуде выживает в течение нескольких недель. Все дезинфицирующие средства (перекись водорода, хлорамин и т. п.) в обычных концентрациях убивают дифтерийную палочку через 1-2 мин, кипячение — мгновенно; под действием прямых солнечных лучей она погибает через несколько часов.