Для идентификации чистой культуры дифтерийной палочки и дифференцировки ее от псевдодифтерийной палочки Гормана исследуют биохимические свойства выделенной чистой культуры. Исследование проводится на средах Гисса или на водно-сывороточной среде (20 %-ной лошадиной сыворотке).
Дифтерийная палочка расщепляет только глюкозу — имеет только столбик, дифтероиды ферментируют глюкозу и сахарозу — синий цвет будет у всей среды, ложнодифтерийная палочка не расщепляет сахаров, но разлагает мочевину — вся среда приобретает оранжевый цвет. На основании реакций ферментации углеводов можно также установить два основных биологических типа дифтерийной палочки: гравис и митис. Формулировка окончательного ответа при положительном анализе: "Выделены токсичные (нетоксичные) дифтерийные палочки", в случае изучения культурально-биохимических признаков указывается принадлежность к типу гравис или митис, а при серотипировании культуры указывается серологический тип.