Site icon Medkurs.ru

Методы исследования активности лактатдегидрогеназы (ход определения)

Ход определения

Опытная проба: 0,1 мл сыворотки, разведенной 1:2, смешивают с 0,3 мл раствора НАД, прогревают 5 мин при температуре 37 °С. Затем добавляют 0,8 мл 0,03 моль/л раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл 0,45 моль/л раствора лактата натрия, предварительно прогретых при температуре 37 °С, и инкубируют смесь при температуре 37 °С в течение 15 мин. Тотчас после инкубации добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина, выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл 0,4 моль/л раствора едкого натра, перемешивают и через 10 мин измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Холостую пробу ставят, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.

Расчет активности производят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика: из рабочего калибровочного раствора пирувата натрия готовят ряд разведений, как указано в табл.

Исследование активности лактатдегидрогеназы

№ пробирки Рабочий калибровочный раствор пирувата натрия (мл) 0,03 моль/л раствор пирофосфата натрия (мл)

Бидистиллированная вода (мл)

Содержание пировиноградной кислоты в калибровочной пробе Активность ЛДГ нмоль/(с∙л)
мкг мкмоль
1 0,1 0,8 0,5 0,88 0,01 334
2 0,2 0,8 0,4 1,76 0,02 668
3 0,4 0,8 0,2 3,52 0,04 1336
4 0,6 0,8 5,28 0,06 2004
5 0,8 0,6 7,04 0,08 2672

Затем в пробирки приливают по 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Далее калибровочные пробы обрабатывают и измеряют, как опытные. Холостую пробу ставят так же, как калибровочную, но вместо калибровочного раствора добавляют воду.

Линейная зависимость между концентрацией пировиноградной кислоты и оптической плотностью сохраняется от 0 до 3000 нмоль/(с∙л).

Exit mobile version