Методы исследования активности ферментов

Методы исследования активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ)

Лактатдегидрогеназа — гликолитический фермент, обратимо катализирующий окисление L-лактата в пировиноградную кислоту. Для лактатдегидрогеназы в качестве промежуточного акцептора водорода требуется НАД.

Реакция, катализируемая лактатдегидрогеназой, может быть представлена в следующем виде:

L-лакгат + НАД ↔ пируват + НАД Н + Н⁺.

Фермент широко распространен в организме человека.

По степени убывания активности энзима органы и ткани могут быть расположены в следующем порядке: почки, сердце, скелетные мышцы, поджелудочная железа, селезенка, печень, легкие, сыворотка крови. В последней обнаружено несколько различных белков (изоэнзимов), обладающих каталитическими свойствами этого фермента. Изменения в строении белковой части изофермента обусловливают их различные физико-химические свойства, что, в частности, сказывается в неодинаковой электрофоретической подвижности разновидностей этого фермента в агаровом, крахмальном, полиакриламидном и других гелях.

В сыворотке крови обнаружено пять изоэнзимов лактатдегидрогеназы: ЛДГ₁, ЛДГ₂, ЛДГ₃, ЛДГ₄, ЛДГ₅, располагающихся в геле в порядке убывания их электрофоретической подвижности. Установлено, что фракция ЛДГ1 происходит в основном из ткани сердца, ЛДГ₅ — из печени. В отличие от последней ЛДГ₁ обладают большей устойчивостью к действию мочевины.

Лактатдегидрогеназа содержится не только в сыворотке, но и в значительном количестве в эритроцитах, поэтому сыворотка, используемая для анализа, должна быть свежей, лишенной следов гемолиза.

Исследование общей активности фермента характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов организма, а определение активности отдельных изоэнзимов ЛДГ способствует диагностике некоторых заболеваний сердца, печени и других органов.

Принцип метода

Лактатдегидрогеназа (L-лактат, НАД-оксидоредуктаза) катализирует превращение лактата в пируват при одновременном восстановлении НАД в НАД(Н), который далее восстанавливает в присутствии N-метилфеназонийметилсульфата йоднитротетразолиевый фиолетовый в красный формазан. Одновременно с определением общей каталитической активности лактатдегидрогеназы можно определять и долю фермента, устойчивого к действию мочевины, что характерно главным образом для изофермента сердечной фракции.

Пределы активности:

ЛДГ при температуре 37 °С — 0,66 0—2,66 мккат/л, Доля фермента, устойчивая к действию мочевины (%), — 60—80.

Метод исследования активности креатинкиназы (КК) КК катализирует обратимую реакцию образования креатинфосфата из креатина и АТФ. Креатинфосфат является макроэргическим фосфатом, используемым мышцами для сокращения,...

Метод исследования активности креатинкиназы (необходимые реактивы)  Необходимые реактивыI.  Аденозин-5-трифосфорной кислоты динатриевая соль. II.  L-цистеин, 0,024 моль/л: 2,9 мг растворяют в 1 мл воды. Готовят раствор перед употреблением....

Метод исследования активности креатинкиназы (ход определения) Предварительно все растворы реактивов прогревают в течение 5 мин при температуре 37 °С. Опытная проба: в пробирку вносят 1,5 мл основной смеси реактивов, 0,1 мл раствора...

Методы исследования активности лактатдегидрогеназы (ход определения) Ход определения Опытная проба: 0,1 мл сыворотки, разведенной 1:2, смешивают с 0,3 мл раствора НАД, прогревают 5 мин при температуре 37 °С. Затем добавляют 0,8 мл 0,03 моль/л...

Методы исследования активности лактатдегидрогеназы (клинико-диагностическое значение) Активность лактатдегидрогеназы в сыворотке крови возрастает при повреждении миокарда, лейкозах, почечных заболеваниях, гемолитической, серповидно-клеточной...